加州理工团队揭示新冠病毒抑制宿主防御的机制 | Cell Press 新冠中心论文速递

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最新在中心上线的发表在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell上，名为"SARS-CoV-2 disrupts splicing, translation, and protein trafficking to suppress host defenses"的研究，来自加州理工的研究团队发现了SARS-CoV-2在人类细胞中的多种致病功能，包括全面抑制宿主mRNA剪接、蛋白质翻译和膜蛋白转运，并描述了病毒干扰这些基本细胞过程的分子机制。

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摘要

SARS-CoV-2是最近发现的冠状病毒，它导致名为COVID-19的呼吸系统疾病。尽管存在迫切的需要，但我们仍然不能完全理解SARS-CoV-2发病机制的分子基础。在此，我们全面揭示了SARS-CoV-2蛋白与人类RNA之间的相互作用。NSP16 结合U1和U2剪接RNA的mRNA识别域，并在SARS-CoV-2 感染时抑制整条mRNA的剪接。NSP1与位于核糖体mRNA进入通道的18S rRNA结合，导致感染时对mRNA翻译的全面抑制。最后，NSP8和NSP9与信号识别粒子中的7SLRNA结合，并在感染时干扰蛋白质向细胞膜的转运。对这些基本细胞功能的破坏抑制了干扰素对病毒感染的应答。我们的研究结果揭示了，SARS-CoV-2利用多管齐下的策略对抗重要的细胞过程，以抑制宿主的防御。

简介

COVID-19在人群中具有高度的可传播性，其广泛播散已导致全球大流行，迄今已造成超过100万人死亡（Andersen et al., 2020; Zou et al., 2020）。我们尚未完全了解SARS-CoV-2病毒感染在人体细胞中发病机制的分子基础。因此，迫切需要理解这些机制，以指导治疗。

SARS-CoV-2编码27种蛋白质，在病毒复制和组装中具有不同的功能（Bar-On et al., 2020; Wang et al., 2020）。16种非结构蛋白（NSP1-16）编码RNA依赖性RNA聚合酶、解旋酶，以及其他病毒复制所需的成分（da Silva et al., 2020）。7种辅助蛋白（ORF3a-8）在病毒复制或组装中的功能基本上仍未得到表征（Chen and Zhong, 2020; Finkel et al., 2020）。

作为专性细胞内寄生的病毒，SARS-CoV-2需要借助宿主细胞成分翻译和运输其蛋白质，并组装和分泌病毒颗粒（Maier et al., 2016）。在受到病毒感染时，哺乳动物的先天免疫系统会迅速检测并阻止病毒感染，无论病毒处于哪个生命周期阶段（Chow et al., 2018; Jensen and Thomsen, 2012; Wilkins and Gale, 2010）。细胞内病毒监测的主要形式涉及干扰素途径，该途径会放大细胞内病毒成分检测产生的信号，从而在感染时诱导免疫系统产生I型干扰素反应（Stetson and Medzhitov, 2006）。具体地说，细胞中含有各种RNA感知因子（如RIG-I和MDA5），它们可以检测病毒RNA的存在，促进转录因子IRF3的核易位，从而引发转录、翻译和干扰素的分泌（如IFN-α和IFN-β）。干扰素与细胞表面受体的同源结合引发了数百个抗病毒基因的转录和翻译。

病毒为了成功复制，会采用一系列策略来对抗宿主的抗病毒反应（Beachboard and Horner, 2016）。许多病毒蛋白除了在病毒生命周期中的基本作用外，还能对抗人类细胞的核心细胞功能，以逃避宿主的免疫应答反应。

最近的研究发现，干扰素反应的抑制是COVID-19严重程度的主要临床决定因素（Zhang et al., 2020），最为严重的病例的特征之一是IFN分泌几乎完全丧失（Hadjadj et al., 2020）。SARS-CoV-2抑制干扰素反应的程度是将COVID-19与SARS和MERS区分开来的一个关键特征（Lokugamage et al., 2020）。SARS和MERS的病原体也会劫持宿主细胞的成分并逃避免疫的检测，针对其机制，既往研究提出了几种思路，包括抑制细胞核中的宿主mRNA转录（Canton et al., 2018）、宿主mRNA在细胞核和细胞质中降解（Kamitani et al., 2009; Lokugamage et al., 2015），以及阻止宿主细胞内的翻译等（Nakagawa et al., 2018）。尽管如此，SARS-CoV-2使用这些或其他策略的程度，以及如何在分子水平上执行这些过程，我们仍不清楚。

了解病毒蛋白和人体细胞成分之间的相互作用对于阐明病毒的致病机制并开发有效的治疗是至关重要的。因为SARS-CoV-2 是一种RNA病毒，已知它编码的许多蛋白结合RNA（Sola et al., 2011），我们认为，这些病毒蛋白可能与特定的人类mRNAs（蛋白质生成的关键中间体）或非编码RNA（ncRNA，不同细胞的关键结构组件）相互作用，从而促进病毒传播。

在此，我们全面地描述了每种SARS-CoV-2蛋白和人类RNA之间的相互作用。我们发现有10种病毒蛋白与mRNA或ncRNAs发生了高度特异性的相互作用，涉及参与宿主细胞蛋白生成的各个步骤。我们发现NSP16与剪接体中U1和U2 RNA成分的mRNA识别域结合，并抑制感染SARS-CoV-2的人类细胞中的mRNA剪接。我们发现NSP1与18S rRNA上的一个精确区域结合，该区域位于起始40S核糖体的mRNA进入通道中。这种相互作用导致了人类细胞感染SARS-CoV-2后mRNA翻译的整体抑制。最后，我们发现NSP8和NSP9结合信号识别粒子（SRP）的7SL RNA组分上多个分散的区域，并在感染时干扰蛋白转运至细胞膜的过程。我们的研究表明，这些基本细胞功能的中断抑制了I型干扰素对病毒感染的反应。总之，我们的结果揭示了，SARS-CoV-2使用一种多管齐下的策略来对抗基本的细胞过程，从而实现对宿主免疫防御的抑制。

结果

我们成功提纯了27种病毒蛋白中的26种（图S1A，全长刺突蛋白在表达时不溶）。我们发现，10种病毒蛋白（NSP1、NSP4、NSP8、NSP9、NSP12、NSP15、NSP16、ORF3b、N和E蛋白）与特定的宿主RNAs（p值＜0.001，图1B，表S1）结合，包括6种结构ncRNAs和142 种mRNAs（表S1）。值得注意的是，我们观察到的相互作用对于每种病毒蛋白都具有极高的特异性，每种蛋白质都结合到每种RNA内的精确区域（图1C，S1F）。利用这些数据，我们确定了几种病毒蛋白，这些蛋白质与剪接体（U1和U2 snRNA）的结构 ncRNA 成分、核糖体（18S和28S rRNA）和信号识别粒子（7SL）发生了相互作用（图1B）。由于这些分子成分对于蛋白质生成的三个基本步骤（mRNA 剪接、翻译和蛋白质转运）至关重要，因此我们关注它们与病毒蛋白的相互作用，以了解它们在 SARS-CoV-2致病机制中的功能和机制。

▲图 S1

▲图 1

NSP16与U1和U2 snRNAs的pre-mRNA识别域结合

RNA剪接（splicing）是由一种名为剪接体（spliceosome）的ncRNAs和蛋白质复合物介导的。我们发现NSP16病毒蛋白与U1和U2 snRNAs之间存在高度特异的相互作用（图1B）。因为U1和U2是小RNAs（分别由164和188个核苷酸所构成），我们注意到NSP16相关的读取在每条全长RNA上都有很强的富集。与与U1/U2的相互作用一致，我们观察到NSP16在SARS-CoV-2感染时定位于细胞核内（图2E,，S2E-F），在人类细胞中的表达也定位于细胞核内（图S2G）。

▲图 2

▲图 S2

NSP16破坏SARS-CoV-2感染时整条mRNA的剪接

根据NSP16结合位点相对于U1/U2剪接体成分的mRNA识别域的位置，我们推测NSP16可能会破坏新转录基因的剪接（图2F）。为了验证这一点，我们使人类细胞中在表达NSP16的同时共表达源于IRF7的剪接报告基因，IRF7是一种外显子-内含子-外显子小基因，与GFP融合（Majumdar et al., 2018）。在这一体系中，如果报告基因被剪接，则生成GFP；否则，翻译将被终止（通过位于第一个内含子中的终止密码子），GFP就不会产生（图3A）。我们观察到，与对照组蛋白相比，NSP16存在时，GFP水平降低了至少3倍（图3B, S3A）。

▲图 3

▲图 S3

为了探索NSP16是否对内源性mRNA的剪接具有全面影响，我们使用新的RNA测序测量了每个基因的剪接比例。我们观察到与对照组相比，在NSP16存在时，未剪接基因的整体比例有所增加（图3D，S3C-D）。

这些结果表明，NSP16结合U1/U2的剪接位点和分支点位点，以抑制SARS-CoV-2感染细胞中整条mRNA的剪接（图3F）。虽然NSP16是一种酶，但我们的结果表明，它也是一种宿主毒力因子。整体破坏mRNA剪接可能通过触发剪接不当的mRNA的无义突变来降低宿主蛋白和 mRNA 的水平（Kurosaki et al., 2019）。与此一致，我们观察到在SARS-CoV-2感染后，稳态mRNA水平（相对于ncRNA水平）整体显著下降（图S3F）。

SARS-CoV-2感染抑制蛋白与细胞膜的结合

由于NSP8和NSP9都足以抑制蛋白进入细胞膜，我们推测SARS-CoV-2感染也会导致类似的抑制。然而，由于NSP1在感染后既抑制膜蛋白的翻译，也抑制非膜蛋白的翻译，研究者迄今未能确定SARS-CoV-2感染是否特异性地影响膜蛋白表达。

为了解决这个问题，我们共表达含有5 '病毒前导区的膜蛋白报告基因（NGFR）与含有病毒前导区的非膜GFP报告基因。在病毒感染后，我们观察到膜蛋白水平明显下降（图7C），但非膜GFP水平没有降低（图5D）。为了确保这些效应是针对SARS-CoV-2感染的，我们将感染细胞群中的单个细胞分组为表达病毒刺突蛋白（S+）的细胞和不表达蛋白（S-）的细胞。我们发现膜蛋白水平的改变只发生在S+细胞中（图7D），而S-细胞群与模拟感染的样本类似（图7C）。我们观察到刺突蛋白水平（可能反映了每个细胞内病毒复制的数量）与膜蛋白抑制水平之间存在很强的关系（图7C）。在受感染的人类肺上皮（Calu3细胞，图S7D）和猴肾（Vero细胞，图7C-D）细胞系中，我们观察到了这种膜蛋白特异性的下降。

▲图 5

▲图 7

▲图 S7

总之，这些结果表明NSP8和NSP9结合至7SL可以破坏SRP功能，并抑制SARS-CoV-2感染细胞的膜蛋白运输。虽然NSP8和NSP9被认为是病毒复制机制的组成部分（Sutton et al.， 2004），但我们的研究结果表明，它们还作为宿主毒力因子发挥了其他作用。由于病毒膜蛋白也需要转运到内质网，病毒对SRP的破坏可能会对病毒的传播产生负面影响，除非病毒蛋白以不依赖于SRP的方式转运（图S7E），或者NSP8/9可能选择性地影响宿主（而不是病毒）蛋白。

病毒通过干扰蛋白质转运过程抑制干扰素反应

接下来，我们探讨了SRP的破坏如何可能有利于病毒传播。由于 IFN 和其他细胞因子的分泌依赖于 SRP 复合物的分泌（图 S7F），因此 IFN 反应的中心组件依赖于SRP。因此，我们假设病毒引起的由NSP8/9介导的SRP抑制将会抑制IFN对病毒感染作出应答。为了测试这一点，我们共表达NSP8和NSP9，并观察到 IFN 反应的显著降低，与对照组蛋白明显不同（图 S7G）。

▲图 S7

总之，这些结果表明，SARS-CoV-2对SRP依赖性蛋白质分泌的抑制能够抑制宿主免疫防御（图7E）。有趣的是，许多参与抗病毒免疫的蛋白质（包括大多数细胞因子和I类主要组织相容性复合物）都会与膜融合或通过膜分泌，并使用SRP通路进行转运（Vermeire et al., 2014年）（图S7F），表明SRP通路的抑制对SARS-CoV-2的致病机制可能有其他影响。

▲图 7

讨论

我们发现了SARS-CoV-2在人类细胞中的多种致病功能，包括全面抑制宿主mRNA剪接、蛋白质翻译和膜蛋白转运，并描述了病毒干扰这些基本细胞过程的分子机制。有趣的是，所有参与其中的病毒蛋白（NSP1、NSP8、NSP9和NSP16）都是在病毒生命周期的第一阶段生成的，早于病毒基因组复制期间产生双链RNA（dsRNA）产物。由于宿主免疫感知因子可检测dsRNA并由此触发 I 型干扰素反应，因此这些细胞过程的中断将使病毒能够复制其基因组，同时最大限度地降低宿主先天免疫应答。

干扰蛋白质产生的这三个非重叠步骤可能代表了一种多管齐下的机制，协同抑制宿主的抗病毒反应（图7F）。这种多管齐下的机制可以解释在重症COVID-19患者中观察到的IFN 受到强力抑制的分子基础。   

干扰素不仅是疾病严重程度的决定因素，而且也是一种潜在的治疗选择（Zhou et al., 2020）。因此，我们的工作确定了在SARS-CoV-2感染时提高IFN水平的几种潜在治疗。例如，干扰NSP1和18S rRNA之间的相互作用可以让细胞检测病毒感染并对此作出应答。由于许多小分子药物将核糖体RNA（Liaud et al., 2019）作为靶点，因此有可能开发相应的药物来阻止NSP1与18S和其他RNA的相互作用。此外，破坏病毒的5'前导区可能是一种强大的抗病毒策略，因为它是关键翻译所有病毒蛋白。由于SL1是一种结构化RNA，因此也有可能设计出一种小分子，专门结合这一结构从而抑制病毒蛋白生成（Hermann, 2016）。另外，病毒对这些细胞功能的抑制并不仅限于IFN反应，还会影响其他被剪接、翻译、分泌的蛋白和膜蛋白。

整体上说，我们希望SARS-CoV-2蛋白与RNA结合的图谱能够给人们提供启发性的见解，这对于探索其他病毒机制来说至关重要。具体来说，我们确定了许多其他的相互作用，包括与 mRNA高度特异性的相互作用。例如，NSP12 与 JUN mRNA的结合（图 S1E），JUN mRNA 编码关键的免疫转录因子c-Jun，这一因子在多种细胞因子和免疫信号通路激活时也会被激活（Weston and Davis, 2007）。虽然目前还不清楚这些相互作用在病毒感染细胞中发挥什么样的作用，但其特异性表明它们可能为病毒传播提供选择性优势。

▲图 S1

总结来说，我们的结果表明，全面绘制与病毒蛋白结合的RNA图谱可以为我们快速表征新兴致病RNA病毒的机制提供帮助。

相关论文信息

原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊Cell上

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▌论文标题：

SARS-CoV-2 disrupts splicing, translation, and protein trafficking to suppress host defenses

▌论文网址：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31310-6

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.004

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中文审校：Cell科学编辑 杨扬

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